آزمایشات کیفی پروتئین ها

آزمایش بیوره

ترکیباتی که دارای حداقل دو اتصال یا پیوند پپتیدی می باشند با یون مس در محیط قلیایی کمپلکس بنفش رنگی تولید می کنند.نام این آزمایش از نام ترکیب بیوره که با یون مس کمپلکس می دهد گرفته شده است. در این آزمایش کمپلکس کئوردینانس بین یون مس و چهار نیتروژن (دو نیتروژن از هر پلی پپتید) ایجاد می شود و دارای رنگ بنفش است.

روش کار

به یک میلی لیتر محلول پروتئین سه میلی لیتر بیوره اضافه نمایید و خوب مخلوط کنید بعد از چند دقیقه به لوله آزمایش نگاه کنید و مشاهدات خود را یادداشت نمایید.این آزمایش را برای چند اسیدآمینه نیز انجام دهید.

دناتوره شدن پروتئین ها

تغییر ماهیت یا تغییر در حالت طبیعی در ساختمان پروتئین دناتوره شدن نامیده می شود.این دگرگونی به خصوص در ساختمان دومین سومین و چهارمین پروتئین رخ می دهد.دناتوره شدن ممکن است قابل بازگشت و یا غیر قابل برگشت باشد.عوامل دناتوره کننده را به دو دسته تقسیم می کنند:

۱٫عوامل شیمیایی مانند اسید ها و بازها ،یون فلزات سنگین،پاک کننده ها و اوره

۲٫عوامل فیزیکی مانند حرارت،نور ماورا بنفش و اشعه ایکس

اگر پروتئین دارای فعالی بیولوپیکی قابل سنجش باشد(مانند آنزیم ها) در این صورت میزان دناتوره شدن را می توان اندازه گرفت.زیرا پروتئین آنزیم در اثر تغییر ماهیت ،فعالیت بیولوژیک خود را از دست می دهد.اگر فعالیت حیاتی پروتئین به آسانی قابل اندازه گیری نباشد برای پی بردن به این که آیا دناتوره شدن پروتئین قابل برگشت است یا نه از عوامل دیگری مانند تغییر حلالیت پروتئین در حلال قبلی خود می توان استفاده نمود.چنانچه پروتئین به صورت غیر قابل بازگشت دناتوره شده و رسوب کرده باشد رسوب حاصل در حلال قبلی به خوبی حل نمی شود.

عواملی مانند حرارت ،یون فلزات سنگین یا بعضی اسیدهای آلی قوی پروتئین را به صورت غیر قابل بازگشت دناتوره نموده و همزمان پروتئین را از محیط خارج می نمایند که به آنها عوامل دپروتئینه کننده می گویند.

الف-دناتوره شدن به وسیله حرارت

 

[vip-members]

گرمای بالاتر از ۵۰ درجه سانتی گراد پروتئین را دناتوره می نماید.در نتیجه پروتئین ماهیت طبیعی خود را از دست داده رسوب می نماید.

روش کار:

دو میلی لیتر محلول آلبومین تخم مرغ (۲ درصد) را در یک لوله آزمایش بریزید و در حمام آب جوش قرار دهید.زمان لازم برای دناتوره شدن پروتئین قابل برگشت است یا نه آزمایش زیر را انجام دهید.

بیست میلی لیتر آب مقطر به لوله آزمایش محتوی پروتئین اضافه نمایید و دقت کنید که آیا رسوب پروتئین باقی می ماند و یا این که در آب حل می شود.در صورتی که رسوب پروتئین در آب حل نشود پروتئین به صورت غیر قابل برگشت دناتوره شده است.نتیجه را با لوله کنترل (دارای دو میلی لیتر محلول آلبومین و ۲۰ میلی لیتر آب مقطر)بدون حرارت مقایسه کنید.

ب-راسب شده پروتئین به وسیله یون فلزات سنگین

پروتئین ها با یون فلزات سنگین ترکیب می شوند و نمک های نا محلول تولید می نمایند.از این خاصیت برای خارج کردن پروتئین ها از محلول استفاده می شود بر همین اساس شیر یا سفیده تخم مرغ به بیماری که با فلزی یون جیوه مسموم شده باشد خورانده می شود.کازئین شیر در معده بیمار با جیوه ترکیب شده رسوب می نماید.

Hg Cl2→۲Cl̄ + Hg++

Hg++ + protein → protein-Hg++ ↓

روش کار

سه میلی لیتر محلول پروتئین (مثلا ۲ درصد آلبومین تخم مرغ) را در یک لوله آزمایش بریزید و به آن یک میلی لیتر محلول کلرید جیوه ۰/۵ مولار و یا کلرید باریم اضافه نمایید . مشاهدات خود را یادداشت کنید و با افزودن آب امتحان کنید که آیا دناتوره شدن قابل برگشت است یا نه؟

ج-راسب شدن پروتئین به وسیله اسیدها

پروتئین ها پلی الکترولیت های آمفوتر می باشند.بنابراین تغییرات PH بر اتصال نمکی آنها که موجب استحکام ساختمان سومین آنها می شود اثر می گذارد.بعضی از اسیدها مثلا اسید تری کلرواستیک،اسید تنگستیک و اسیدسولفالسیلیک با غلظت متوسط موجب دناتوره شدن و رسوب پروتئین می شوند.از این رو برای خارج کردن پروتئینها از مایعات بیولوژیکی می توان این اسید ها را به کار برد.مثلا پروتئین ها به وسیله این اسیدها رسوب داده می شوند و مایعات فاقد پروتئین تهیه می گردد.

CCL3CCOH→ H+ + CCL3COO

H+ + protein → protein +

Protein+ + CCL3COO- → protein-ooc-cl3 ↓

روش کار

۱-سه میلی محلول پروتئین ( ۲ درصد محلول آلبومین تخم مرغ) را در یک لوله آزمایش بریزید و به آن اسید تری کلرواستیک (TCA ) و یا اسید سولفوسالسیلیک (ده درصد) اضافه نمایید و خوب مخلوط کنید.

۲-با اضافه نمودن ۲۰ میلی لیتر آب و با مقایسه با لوله کنترل امتحان کنید که آیا دناتوره شدن پروتئین قابل برگشت است یا نه؟

د)راسب شدن پروتئین ها به وسیله حلال های آلی مانند الکل و استون

قابلیت حل پروتئین ها در محلول های مائی به واکنش هیدروفیلیک بین مولکول های قطبی آب و گروه های یونیزه شده موجود در مولکول پروتئین بستگی دارد.عواملی که ثابت دی الکتریک محلول مائی را تغییر دهد در حلالیت پروتئین در محلول مائی اثر می گذارد.

مثلا اضافه کردن اتانول یا استون سرد (۲۰- درجه سانتی گراد) به محلول های پروتئین موجب راسب شدن پروتئین می شود.در درجه حرارت های پایین (معمولا درجه حرارت زیر صفر درجه سانتی گراد)حلال های آلی پروتئین را رسوب می دهند تحت این شرایط فعالیت حیاتی پروتئین نسبتا حفظ می شود(دناتوره شدن قابل برگشت).از این روش برای جدا کردن و خالص کردن پروتئین ها استفاده می شود زیرا با اضافه کردن مرحله به مرحله حلال آلی مثل استون به محلول پروتئین ,پروتئین های مختلف در مرحله اول رسوب می نمایند.علت رسوب کردن پروتئین این است که در اثر اضافه کردن حلال آلی ثابت دی الکتریک آب پایین می آید و نیروی جاذبه بین مولکول های پروتئین بیشتر از نیروی جاذبه پروتئین و آب شده در نتیجه رسوب می نمایند.

روش کار

۱-دو میلی لیتر محلول پروتئین را در یک لوله آزمایش بریزید و قطره قطره حلال آلی را اضافه نمایید تا پروتئین رسوب کند.

۲-با اضافه نمودن ۲۰ میلی لیتر آب و مقایسه آن با لوله کنترل امتحان کنید که آیا دناتوره شدن پروتئین قابل برگشت است یا نه؟

ه)راسب شدن پروتئین به وسیله نمک های خنثی

وجود سایر یون ها در محلولی که پروتئین دارد در حلالیتپروتئین اثر دارد پروتئین در حالت محلول به وسیله یک اتمسفر یونی احاطه شده است.این اتمسفر یونی باعث تغییر حلالیت پروتئین می شود.املاح خنثی در غلظت های کم,حلالیت تعداد زیادی از پروتئین ها را زیاد می نماید.به این پدیده اثر Salting in می گویند.نمک هایی دو ظرفیتی مانند سولفات آمونیوم بیشتر از نمک های یک ظرفیتی مانند پتاسیم کلراید و یا سدیم در عمل salting in موثر می باشند.زیرا در یک مولاریته معین قدرت یونی املاح دو ظرفیتی بیشتر است .از طرف دیگر هر چه غلظت نمک بیشتر شود قابلیت حل پروتئین در محلول کمتر می شود.در غلظت های زیاد ممکن است پروتئین کاملا رسوب نماید به این پدیده salting out گفته می شود.

I=1/2 ∑Ci zi2
در این رابطه I قدرت یونی و Ci غلظت بر حسب مولار اجزای یونی و zi بار الکتریکی یونها می باشد.

اساس فیزیکوشیمیایی عمل salting out کاملا پیچیده است .در محلول پروتئین و یون املاح موجود برای جذب مولکول آب رقابت وجود دارد.در غلظت های زیاد املاح موجود در محلول ,مولکول های آب اطراف پروتئین (آب ئیدراتاسیون ) را از پروتئین جدا می نماید.در نتیجه حلالیت پروتئین کم شده و رسوب می نماید

[/vip-members]

 

2

نظر

  1. مینا کریمی  دی 10, 1392

    از این که میبینم هموطنان عزیزم در تهیه پایگاههای علمی موفق و کوشا هستند بی نهایت خوشحال و خرسندم با آرزوی موفقیت روزافزون.بدرود

     پاسخ"  
  2. میثم  اردیبهشت 18, 1395

    Mer30.عالی بود

     پاسخ"  

افزودن نظر