استخراج DNA از بافت گیاهی

مواد گیاهی یکی از سخت ترین موارد برای اشتخراج DNA با کیفیت بالا می باشد. مهم  این است بافت مورد نظر برا استخراج DNA به درستی آماده شود. برای استخراج DNA از بافت گیاهی در اغلب موارد از نیتروژن مایع و بافت گیاهی یخ زده استفاده می شود اما به دلیل این که استفاده از نیتروژن مایع در فضای باز آزمایشگاه خطرناک می باشد و همچنین دسترسی به آن سخت است از یک سری   پروتکل های اصلاح شده برای استخراج DNA از بافت های تازه استفاده می شود. همچنین از بافت های آماده برای انجام سریع تر استخراج استفاده می شود.

معرف ها و بافرها:

استخراج بافر(A (EBA:(هر 100 میلی لیتر)

 

[vip-members]

(CTAB) هگزادسیل تری متیل آمونیوم بروماید 2 درصد                     2 گرم

  10 mL                                                   100 mM Tris (pH 8.0)

1L                                                                         20 mM EDTA

                             8.2g                                                                             1.4 M NaCl

             4g                                                 (PVP)پلی وینیل پیرولیدون 4 درصد

          0/1g                                                                 آسکوربیک اسید 1 درصد

                  70 µL                            10 mM β-mercapto ethanol (BME)

:(هر 100 میلی لیتر)  (EBB) :Bاستخراج بافر

             10mL                                                    100 mM Tris-HCl (pH 8.0)

       2/5mL                                                                               50 mM EDTA

              0.6g                                                                                 100 mM NaCl

                                         70µL                                      10 mM β-mercapto ethanol (BME)

بافر TE(هر 100 میلی لیتر):

                1mL                                                                   10 mM Tris (pH 8.0)

             50 µL                                                                                     1mM EDTA

:سایر معرف های ضروری

20% (w/v) sodium dodecyl sulphate (SDS)

5 Mپتاسیم استات
(PH5.2)   3Mسدیم استات

اتانول 70 درصد

 Absolute isopropano

پروتکل استخراج:

0.3 گرم از بافت گیاهی

بافت گیاهی را روی یک اسلاید شیشه ای تمیز قرار دهید و با یک تیغ آن را ریز ریز کنید.

بافت را سریع به یک لوله میکروسانتریفیوژ 1.5 میلی لیتری انتقال دهید.

پس از آماده شدن نمونه 300 میکرولیتر EBA و 900 میکرولیتر EBB  و 100 میکرولیتر SDS به آن اضافه کنید.

لوله را به مدت 10 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد ورتکس کنید.

لوله را روی یخ قرار دهید و 410 میکرولیتر پتاسیم استات به آن اضافه کنید ومحتویات لوله را به مدت 3 دقیقه با وارونه کردن مخلوط کنید.

به مدت 15 دقیقه در دور 13200rpm سانتریفیوژ کنید. بعد از سانتریفیوژ دما را به 4 درجه سانتی گراد برسانید.

1 میلی لیتر از محلول رویی را به یک لوله میکروسانتریفیوژ 1.5 میلی لیتری انتقال دهید. سپس 540 میکرولیتر آبسولوت پروپانول یخ زده به آن اضافه کنید. سپس لوله را به مدت 20 دقیقه در یخ قرار دهید.

به مدت 10 دقیقه در دور 10200rpm سانتریفیوژ کنید.محلول رویی را دور بریزید. رسوب را با 500 میکرو لیتر اتانول 70 درصد بشویید و اجازه دهید خشک شود.

رسوب را در 600 میکرولیتر بافرTE غوطه ور کنید. 60 میکرولیتر سدیم استات 3 مولار با 5.2PH به آن اضافه کنید و 360 میکرولیتر آبسولوت پروپانول یخ زده هم اضافه کنید.لوله را به مدت 20 دقیقه روی یخ قرار دهید.

مراحل 9 تا 11 را دوباره تکرار کنید.

رسوب (حاوی DNA) را در50 میکرولیتر بافر TE غوطه ور کنید و آن را به ژل آگارزQC منتقل کنید.

ژل آگارز QC:

ژل آگارز را در بافر TBE قرار دهید به طوری که در بافر شناور باشد.

5 میکرولیتر از DNA استخراج شده به همراه5 میکرولیتر آب مقطر را در یک میکروتیوب 0.2 میلی لیتری می ریزیم و 2 میکرولیتر رنگ ردیابی ژل به آن اضافه می کنیم.

Run کردن ژل به مدت 20 دقیقه در 100V.

وقتی ژل لکه دار شد نتیجه را مشاهده می کنیم.

استخراج DNA

[/vip-members]

0
  مطالب مرتبط

افزودن نظر