Incorporation of Digoxigenin-dUTP into DNA Using Nick Translation

1. Prepare a bulk mix of all chemicals except DNA:

STOCK                                                          [FINAL]                                                               (2.5% Dig)50 μl RXN
10 X NT  Buffer                                              1X                                                                                        5.0 μl
10 mM dATP                                             100 μM                                                                                  0.5 μl
10 mM dCTP                                              100 μM                                                                                  0.5 μl
10 mM dGTP                                              100 μM                                                                                  0.5 μl
10 mM TTP                                               97.5 μM                                                                          0.4875 μl
1 mM Dig-dUTP                                         2.5 μM                                                                              0.125 μl
10 X Enzyme Mix                                 2.5 U Pol I                                                                                5.0 μl
0.0375 U DNase I
ddH2O                                                                                                                                                 to make 50.0 μl
DNA                                                              0.5-1 μg                                                                         up to 38.0 μl
2. Add desired amount of DNA to 500 μl microfuge tubes.
3. Add proper amount of bulk mix to each tube containing DNA.
4. Incubate at 16•C for 1-2 h.
5. Stop the reaction by adding 2 μl of 0.5 M EDTA-8.0.
6. Unincorporated dig-dUTP can be removed by either ethanol precipitation or by Sephadex G-50 spin columns
(p. 22)

7. Check incorporation of dig-dUTP by following the procedures described on p. 24.

10 X NT Buffer (from BRL Bionick Kit)
500 mM   Tris-7.8
50 mM   MgCl2
100 mM B-mercaptoethanol
100 μg/ml BSA (nuclease-free)

Enzyme Mix (from BRL Bionick Kit)
0.5 U/μl DNA Polymerase I                                          1 mM B-mercaptoethanol
0.0075 U/μl DNase I                                                       0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride
50 mM Tris-HCl, pH 7.5                                                 50 % glycerol
5 mM MgOAc                                                                      100 μg/ml BSA (nuclease-free)

0

Add a Comment