استخراج RNA از خون

در روش استخراج RNA همه ی ابزارها و معرف های مورد استفاده باید عاری از آلودگی RNAای باشند.

مواد:

1 – تیوب های میکر.فیوژ(1/5ml)

2 – ظرف یخ

3 – میکروفیوژ

4 – بافر ایز سلول های قرمز : 1/6M ساکارز، تریتون 100-X    پنج درصد، 25mM MgCl2 ، 60 mM Tris-HCl ، pH 7/5 ، نگهداری در 2 تا 8 درجه سانتی گراد و استفاده در شرایط سرد

5 – بافر استخراج: گوانیدینیوم تیوسیانات 5/25M ، 50 Mm Tris –HCl ، 6/4 Ph ، 20mM EDTA، تریتون 100-x یک درصد، B 0/1 M-مرکاپتواتانول (درست قبل از استفاده اضافه شود).

6 – سدیم استات 2M ، 4 Ph
7 – فنل (اشباع شده با 1M Tris – HCl : 0/1 M EDTA، 8 PH
8- کلروفروم: ایزو- آمیل الکل (24:1)

9 – ایزوپروپیل الکل

10 – اتانول 70 درصد

11 – آب مقطر عاری از RNase

روش:

1 – در یک تیوب میکروفیوژ ، μL 100 خون غیر منعقد را همراه با mL1 بافر لیز کننده ی سلول های قرمز مخلوط کنید.

 

[vip-members]

2 – نمونه را در دمای اتاق قرار دهید گاها آن را تکان داده ، تا سلول ها لیز شوند و محلول شفاف شود (به طور معمول در عرض 5 دقیقه)

3 – به مدت 30 ثانیه در 1300g میکروفیوژ کنید تا سلول های سفید خون رسوب کنند. روی محلول را جدا کنید و دور بریزید.

4 – 200μL از بافر استخراج را اضافه کنید و باته یک سوزن باریک سلول ها را به حالت سوسپانسیون درآورید.

5 – 20 μL سدیم استات اضافه کنید و با inverrsion به طور کامل مخلوط نمایید.

6 – 220 μL فنل اضافه کنید و با inverrsion به طور کامل مخلوط نمایید.

7 – 60 μL کلروفرم / ایزوآمیل الکل(1:24) اضافه کنید و ورتکس کنید.

8 – برای 15 دقیقه بر روی یخ قرار دهید.

9 – به مدت 20 دقیقه و در 12000g میکروفیوژ کنید و فاز بالایی را به یک تیوب میکروفیوژ جدید انتقال دهید.

10 – 200μL ایزوپروپانول سرد شده با یخ را اضافه و مخلوط کنید و به مدت 30 دقیقه در منفی 20 درجه نگهدارید.

11 – به مدت 15 دقیقه و در 12000g میکروفیوژ کنید و روی محلول را دور بریزید.

12 – رسوب را با 200μL بافر استخراج به حالت سوسپانسیون در آورید.

13 – مراحل 3 تا 9 را تکرار کنید.

14 – رسوب را با 400μL اتانول 70 درصد بشویید.

15 – به مدت 15 دقیقه و در 12000g میکروفیوژ کنید و روی محلول را دور بریزید.

16 – به دقت آخرین آثار اتانول را از تیوب حذف کنید(با یک سواب استریل)

17 – در 100μL آب مقطر به حالت سوسپانسیون درآورید و برای و برای حل شدن RNA ، به مدت 15 دقیقه در 50 درجه انکوبه کنید.

[/vip-members]

 

0

افزودن نظر