بلاگ

رنگ آمیزی اسید فاست یکی از مهم ترین روش های تشخیصی میکروباکتریوم ها به ویژه میکروباکتریوم توبرکلوزیس و میکروباکتریوم لپره محسوب می شود. علاوه بر این با استفاده از رنگ آمیزی اسید فاست می توان اکتینومیست های جنس نوکاردیا از جمله نوکاردیا استروئیدس و نوکاردیا برازیلنسیس را که به عنوان عوامل نوکاردیوزیس ریوی مطرح هستند شناسایی نمود. همچنین تک یاخته انگلی کریپتوسپوریدیوم که عامل عفونت گوارشی و اسهال در انسان می باشد با این روش قابل شناسایی است.
[vip-members]مقدمه
میکروباکتریوم ها باسیل های بدون حرکت و بدون اسپور می باشند که در دیواره سلولی خود علاوه بر پپتیدوگلیکان، مقادیر زیادی گلیکولیپید به ویژه اسید میکولیک دارند، به طوری که حدود 60 درصد دیواره سلولی باکتری را اسید میکولیک تشکیل می دهد.
دیواره سلولی این باکتری ها شبیه موم (wax) بوده و نسبتا غیر قابل نفوذ است. اسید میکولیک و سایر گلیکولیپیدها نفوذ مواد شیمیایی مورد نیاز برای رشد باکتری ها را آهسته می کند، همچنین باکتری را در مقابل عوامل شیمیایی باکتری کش و ترکیبات لیزوزومی محافظت می نماید. حتی این باکتری ها را در مقابل خشکی مقاوم می سازد. با این وجود باسیل سل توسط پاستوریزاسیون و سترون سازی عادی توسط حرارت به آسانی از بین می رود.
میکروباکتریوم ها به شدت هوازی هستند و رشد بسیار آهسته ای دارند. (زمان دو برابر شدن باکتری 18 ساعت است). میکوباکتریوم های پاتوژن انسانی به 2 تا 6 هفته انکوباسیون در محیط های کشت پیچیده نیاز دارند. میکوباکتریوم لپره عامل بیماری جذام را نمی توان در محیط های کشت میکروبی پرورش داد. سرعت کم رشد این باکتری ها سبب شده که سرعت تشخیص آن نسبت به سایر باکتری ها بسیار کمتر باشد، به همین دلیل روش های سریع تشخیصی از جمله تست های سرولوژیکی و ایمونولوژیکی و تست های سریع مولکولی ابداع شده اند.
توجهات ایمنی کار با میکروباکتریوم ها
ماهیت خطرناک بیماری سل و انتقال سریع آن از راه هوا سبب شده که مراقبت های ویژه ای جهت کار با میکوباکتریوم ها مد نظر قرار گیرد. در همین راستا آزمایشگاه های تخصصی با امکانات ویژه جهت جداسازی و تشخیص این باکتری ها مورد استفاده قرار می گیرند. مهمترین نکات ایمنی که هنگام کار با نمونه های مشکوک به سل باید رعایت شوند، عبارتند از:
1 – حفاظت شخصی
2 – تهویه مناسب
3 – استفاده از کابینت های حفاظتی
4 – استفاده از ضدعفونی کننده های مناسب از جمله هیپوکلریت سدیم، فرم آلدئید و فنل
جمع آوری و آماده سازی نمونه
جداسازی موفقیت آمیز میکوباکتریوم ها به جمع آوری و انتقال صحیح نمونه بستگی دارد. در بیماری سل جمع آوری نمونه های بالینی از نقاط مختلف بدن صورت می پذیرد که عبارتند از: نمونه ترشحات تنفسی مانند خط یا آسپیره ریه، ادرار، مدفوع، خون و مایع مغزی- نخاعی.
برای تشخیص بیماری سل، حداقل 3 نمونه خلط صبحگاهی از بیمار گرفته می شود. نمونه ها باید در حجم 5 تا 10 میلی لیتر با سرفه های عمیق صبحگاهی جمع آوری شوند. نمونه های نقاط غیر استریل بدن از جمله دستگاه تنفس، قبل از کشت آماده سازی می شود، ولی نمونه هایی که از مناطق استریل بدن مثل خون جمع آوری می شوند، نیازی به آماده سازی نداشته و تنها باید تغلیظ گردند.
آماده سازی نمونه
آماده سازی نمونه شامل مراحل هموژنیزاسیون، حذف آلودگی و تغلیظ نمونه می باشد. برای این منظور می توان از موادی نظیر هیدروکسید سدیم (NaOH) و N-استیل L-سیستئین استفاده نمود.
NaOH با غلظت 2 تا 4 درصد می تواند هم به عنوان هضم کننده و هم کشنده سایر میکروب ها عمل کند. اما استفاده از آن بایستی با دقت صورت گیرد، زیرا در زمان بیش از 15 دقیقه میکوباکتریوم ها نیز در خطر نابودی قرار می گیرند. بنابراین با کمک معرف فنل رد و اسید کلریدریک در کمتر از 15 دقیقه مراحل خنثی سازی انجام می شود.
استفاده توام از N-استیل L-سیستئین به همراه NaOH به عنوان هضم کننده موکوس می تواند باعث شود که غلظت کمتری از هیدروکسید سدیم مورد استفاده قرار می گیرد.
در نمونه های مشکوک به آلودگی با پسودوموناس مثل خلط بیماران مبتلا به سیستیک فیبروزیس، از اسید اگزالیک 5 درصد برای آماده سازی استفاده می شود.
برای تغلیظ نمونه از سانتریفوژ با سرعت g3000 به مدت 15 دقیقه بهره می گیرند. با این عمل میکوباکتریوم ها در انتهای لوله جمع شده و پس از خالی نمودن محلول رویی، از رسوب حاصل جهت رنگ آمیزی و کشت استفاده می شود.
تست توبرکولین
در روند اولیه، میزبان نسبت به باسیل های سل دچار ازدیاد حساسیت شده و این امر از طریق مثبت شدن تست جلدی یا واکنش توبرکولین مشخص می شود. تست مثبت توبرکولین نشان می دهد که شخص در گذشته به باسیل سل آلوده شده و همچنان میکروباکتریوم های زنده را در برخی از بافت های خود حمل می کند، ولی نمی توان به بیماری فعال یا ایمنی نسبت به بیماری پی برد. افرادی که تست جلدی مثبت دارند در معرض خطر پیشرفت بیماری از طریق فعال شدن مجدد عفونت اولیه می باشند، در حالی که افراد توبرکولین منفی کسانی هستند که قبلا هرگز به باسیل سل آلوده نشده اند و در معرض بیماری نیستند. برای انجام این تست پروتئین های خالص مشتق شده (PPD) را به میزان 5 واحد توبرکول به صورت زیر جلدی به فرد مشکوک تزریق می کنند، در صورتیکه پس از 48 تا 72 ساعت سفتی بیش از 10 میلیمتر مشاهده گردد دلیل بر مثبت بودن تست می باشد. البته افرادی که واکسن BCG دریافت کرده اند، نتیجه مثبت کاذب نشان می دهد.
کشت و ایزولاسیون میکوباکتریوم ها
میکوباکتریوم ها به شدت هوازی بوده و رشد بسیاری آهسته ای دارند. زمان دو برابر شدن باکتری (G.T) به طور متوسط 12 ساعت و در مورد باسیل سل 20 تا 22 ساعت می باشد. سریع رشد ترین میکوباکتریوم ها در مدت 2 تا 3 روز رشد کرده و میکوباکتریوم های بیماری زا در طی 2 تا 6 هفته رشد می نمایند. در محیط حاوی 5 تا 10 درصد دی اکسید کربن رشد بهتری دارند.
محیط های مناسب کشت برای میکوباکتریوم ها
Egg Based Media – این محیط حاوی تخم مرغ، پودر سیب زمینی، گلیسرول، املاح و رنگ مالاشیت گرین است. مالاشیت گرین از رشد باکتری های گرم مثبت جلوگیری می کند. مثال Lowenstein Jensen
Serum or Agar Based Media – محیط های سرم آلبومین مانند محیط میدلبروگ آگار (Middlebrook) شامل نمک های مختلف، ویتامین ها، کوفاکتورها و مالاشیت گرین می باشد که با اسید اولئیک و آلبومین گاوی غنی شده است. این محیط شفاف بوده و می توان با بزرگنمایی کم میکروسکوپ کلنی های اولیه را در محیط کشت شناسایی کرد.
Liquid Media – در محیط های مایع، گونه های میکوباکتریوم می توانند سریع تر رشد کنند. محیط میدلبروگ براث جهت کشت مجدد (Subculture) سویه های ذخیره (Stock) استفاده می شود.
تست های تشخیصی میکوباکتریوم ها
برای تشخیص میکوباکتریوم ها ابتدا رنگ آمیزی اسید فاست انجام شده سپس نمونه را بر روی محیط های جامد کشت می دهند و خصوصیات فنوتیپی از قبیل مورفولوژی کلنی، سرعت رشد، دمای بهینه رشد، واکنش های بیوشیمیایی و پیگمانتاسیون نسبت به نور مورد بررسی قرار می گیرد.
خصوصیات کلنی – میکوباکتریوم ها به دلیل وجود فاکتور طنابی (Cord factor) که باعث ایجاد رشته های خمیده باسیل می شود، کلنی خشک و خشن به رنگ سفید شیری تا کرم رنگ ایجاد می کنند.
سرعت رشد – بسته به گونه میکوباکتریوم از 3 تا 60 روز متغیر است.
واکنش در برابر نور – میکوباکتریوم ها نسبت به نور 3 نوع واکنش نشان می دهند که عبارتند از :
الف – فتوکرموژن (Photochromogen) – گونه هایی که در مجاورت نور رنگدانه های کاروتن ایجاد می کنند.
ب – اسکوتوکروموژن (Scotochromogen) – گونه هایی که هم در تاریکی و هم در روشنایی ایجاد رنگدانه می کنند.
ج – غیر کروموژن (Nonchromogen) – گونه هایی مانند میکوباکتریوم توبرکلوزیس که در هیچ شرایطی قادر به تولید رنگدانه نیستند.
تست های بیوشیمیایی
این تست ها به دلیل سرعت آهسته رشد ممکن است چندین هفته به طول انجامد. مثل تست تجمع نیاسین، تست احیا نیترات، تست پیرازین آمیداز، تست احیا تلوریت و …
رنگ آمیزی اسید فاست
این تکنیک اولین بار توسط Dr.Franz Zeehl و Dr.Friedrich Neelsen ابداع شد. واژه اسید فاست به معنی مقاومت در مقابل رنگ بری با یک رنگ بر قوی اسیدی می باشد. این خاصیت در باکتری های جنس میکوباکتریوم و نوکاردیا و تک یاخته کریپتوسپوردیوم وجود دارد.
باکتری های اسید فاست به دلیل دیواره مومی (wax) تقریبا نفوذ ناپذیر بوده و به سادگی با رنگ های روتین رنگ نمی شوند. رنگ کربول فوشین محلول در چربی است، همچنین دارای فنل می باشد که نفوذ رنگ به داخل دیواره سلولی را تسهیل می کند. از طرفی این فرآیند با کمک حرارت به انجام می رسد. اسمیر رنگ شده با رنگ برهای بسیار قوی (اسید کلریدریک 3 درصد و اتانول 95 درصد) رنگ زدایی نمی شود و رنگ اولیه را حفظ می کند. در این پروسه جهت رنگ آمیزی باکتری های غیر اسید فاست که رنگ اولیه را از دست داده اند، از رنگ متضاد متیلن بلو استفاده می شود. در این تکنیک باکتری های اسید فاست به رنگ قرمز و مواد زمینه و سایر باکتری ها به رنگ آبی مشاهده می شوند.
روش دیگر برای مشاهده میکوباکتریوم ها استفاده از رنگ اورامین و رودامین است، با این روش باکتری ها رنگ فلورسنت را جذب کرده و با اسید آن را از دست نمی دهند. مطالعه اسلایدها با بزرگنمایی 40X میکروسکوپ صورت می گیرد و باکتری ها به صورت نقاط نورانی در یک زمینه سیاه دیده می شوند. در این روش مدت زمان کمتری برای مطالعه اسلاید صرف می شود، در مقابل نیاز به میکروسکوپ فلورسنت دارد و واکنش های مثبت کاذب به دلیل رسوب رنگ یا رنگ گرفتن ترکیبات خاص با رنگ فلورسنت مشاهده می شود.

رنگ آمیزی اسید فاست

تشخیص میکوباکتریوم ها با رنگ آمیزی اسید فاست

روش کار
روش زیل نلسون (Ziehl Neelsen – Hot Stain)
1 – یک قطره از مایع واکسن BG را در مرکز یک لام قرار داده و با یک لوپ از باکتری غیر اسید فاست مانند اشریشیاکلی مخلوط کنید سپس بر سطح لام گسترش تهیه نمایید.
2 – اجازه دهید تا اسلاید در دمای آزمایشگاه خشک شود.
3 – اسلاید را 3 مرتبه از روی شعله عبور داده و به کمک حرارت تثبیت کنید.
4 – یک تکه کاغذ صافی بر روی لام قرار دهید و با گیره مخصوص اسلاید را نگه دارید.
5 – روی کاغذ صافی و اسلاید را با رنگ کربول فوشین بپوشانید و بر روی شعله گرفته و اجازه دهید تا رنگ تبخیر گردد. این کار را به مدت 5 دقیقه ادامه دهید.( اجازه ندهید رنگ بجوشد، همچنین اگر رنگ خشک شد سریعا مقدار کمی رنگ به آن اضافه کنید)
6 – اجازه دهید اسلاید سرد شود، سپس کاغذ صافی را بردارید و به مدت 30 ثانیه با آب شستشو دهید.
7 – با اسید-الکل عمل رنگ بری را انجام دهید، رنگ بر را قطره قطره بر سطح لام بریزید تا کربول فوشین از روی اسمیر شسته شود، به طوری که آخرین قطره خارج شده از لام بی رنگ باشد.
8 – اسلاید را به ملایمت با آب بشویید.
9 – سطح لام را با رنگ متیلن بلو به مدت 60 ثانیه بپوشانید.
10 – اسلاید را به ملایمت با آب بشویید.
11 – اسلاید را خشک کرده و با عدسی 100X و روغن مشاهده کنید.
روش کانیون (Kinyoun – Cold Stain)
این روش معروف به روش سرد است. زیرا در این روش با افزایش میزان فنل در ترکیب رنگی کربول فوشین (موسوم به فوشین کانیون) دیگر نیازی به حرارت دادن گسترش نیست.
1 – یک گسترش از باکتری مورد آزمایش بر روی اسلاید تهیه کنید.
2 – اجازه دهید تا اسلاید در دمای آزمایشگاه خشک شود.
3 – اسلاید را 3 مرتبه از روی شعله عبور داده و به کمک حرارت تثبیت کنید.
4 – با رنگ کربول فوشین کانیون گسترش را به مدت 5 دقیقه بپوشانید.
5 – به آرامی اسلاید را با آب شستشو دهید.
6 – با اسید – الکل عمل رنگ بری را انجام دهید، رنگ بر را قطره قطره بر سطح لام بریزید تا کربول فوشین از روی اسمیر شسته شود، به طوری که آخرین قطره خارج شده از لام بی رنگ باشد.
7 – اسلاید را به ملایمت با آب بشویید.
8 – با معرف متیلن بلو به مدت یک دقیقه گسترش را بپوشانید.
9 – به آرامی اسلاید را با آب شستشو دهید.
10 – اسلاید را خشک کرده و با عدسی 100X و روغن آن را مشاهده کنید.
نکات مهم
1 – مراقب باشید در زمان حرارت دادن، هرگز رنگ کربول فوشین نجوشد و یا خشک نشود.
2 – قبل از مرحله شستشو با آب، از سرد بودن اسلاید اطمینان حاصل کنید، زیرا احتمال شکستن اسلاید داغ در زمان شستشو با آب سرد وجود دارد.
3 – در مطالعات بالینی، شدت نور میکروسکوپ (موقعیت دیافراگم و عدسی کندانسور) در کیفیت تصویر و افتراق میکروارگانیسم های اسید فاست از سایر میکروارگانیسم ها و اجرام موجود در خلط بیمار نقش محوری دارد.
4 – همانند رنگ آمیزی گرم، در این روش نیز خاصیت اسید فاست یک صفت مطلق نمی باشد و معمولا میکوباکتریوم های جوان به دلیل عدم تجمع لیپید در غشا سلولی به صورت غیر اسید فاست رنگ نمی شوند.[/vip-members]