جداسازی رنگیزه های فتوسنتزی با روش کروماتوگرافی کاغذی

هدف آزمایش:

جداسازی رنگیزه های فتوسنتزی با روش کروماتوگرافی کاغذی

وسایل مورد نیاز آزمایش:
1.کاغذ کروماتوگرافی 2.هاون 3.ترازو 4.بشر
5.پی پت پاستور 6.خط کش 7.فویل آلومینیومی

مواد مورد نیاز آزمایش:
1.برگ اسفناج 2.استون80% 3.اتر نفت

مقدمه:

کلروپلاست و رنگدانه ها

زندگی در روی کره ی زمین به انرژی حاصل از خورشید وابسته است. فتوسنتز تنها فرایند مهم بیولوژیکی است که می تواند از این انرژی استفاده کند. علاوه بر این بخش عمده ای از منابع انرژی در این سیاره ناشی از فعالیت های فتوسنتزی انجام شده در این زمان یا در زمان های گذشته می باشد. فعال ترین بافت فتوسنتزی گیاهان عالی مورفیل برگ است. سلول های مزوفیل دارای تعداد زیادی کلروپلاست هستند که حاوی رنگدانه های سبز ویژه ای به نام کلروفیل برای جذب نور می باشند.

 

[vip-members]

در فتوسنتز انرژی خورشیدی برای اکسیداسیون آب، آزاد کردن اکسیژن و نیز احیا کردن دی اکسید کربن به ترکیبات آلی و در نهایت قند بکار می رود. این مجموعه از کارها را واکنش های تاریکی فتوسنتز گفته می شود. محل انجام واکنش های نوری و تاریکی در داخل کلروپلاست متفاوت است.

رنگدانه های فتوسنتزی:

انرژی نور خورشید ابتدا به وسیله رنگدانه های نوری گیاهان جذب می شود. همه رنگدانه هایی که در فتوسنتز فعالیت دارند در کلروپلاست یافت می شوند .کلروفیل ها و باکترو کلروفیل ها که در بعضی از باکتری ها یافت می شوند رنگدانه های رایج موجودات فتوسنتز کننده هستند. البته همه موجودات فتوسنتز کننده دارای مخلوطی از بیش از یک رنگدانه ها هستند که هر کدام عمل خاصی را انجام می دهند. از دیگر رنگدانه ها می توان به کارتنوئیدها و گزانتوفیل اشاره کرد.

کلروپلاست محلی است که در آن فتوسنتز صورت می گیرد.

برجسته ترین خصوصیت ساختمانی کلروپلاست ، سیستم فشرده غشاهای درونی است که به تیلاکوئید معروف است. کل کلروفیل در این سیستم غشایی که محل واکنش نوری فتوسنتز است قرار گرفته است . واکنش های احیای کربن یا واکنش های تاریکی در استروما (ناحیه ای از کلروپلاست که بیرون تیلاکوئید قرار گرفته است) صورت می گیرند.

تیلاکوئید ها خیلی نزدیک به هم قرار گرفته اند که به تیغه های گرانا موسومند.

مکانیسم جذب نور در گیرنده های نوری:

موجودات فتوسنتز کننده دارای دو مرکز نوری متفاوت هستند که پشت سر هم آرایش یافته اند و سیستم های نوری 1 و 2 نام دارند . سیستم های گیرنده در رده های مختلف موجودات فتوسنتز کننده تفاوت قابل ملاحظه ای دارند. در صورتی که مراکز واکنش حتی در موجوداتی که نسبتا اختلاف دارند یکسان دارند. مکانیزمی که از آن طریق انرژی  تحریک کننده از کلروفیل به مرکز واکنش می رسد ،اخیرا به صورت انتقال رزونانس از آن یاد شده است.در این فرآیند فوتون ها به سادگی از یک مولکول کلروفیل دفع و توسط مولکول دیگر جذب نمی شود .بیشتر انرژی تحریک کننده از طریق فرآیند غیر تشعشعی از یک مولکول به مولکول دیگر منتقل می شود.

برای انجام کروماتوگرافی بر روی کاغذ مخصوص کروماتوگرافی به فاصله چند سانتی متر از انتهای کاغذ مقدار معینی از محلول مورد مطالعه را قرار داده و تعداد مشخصی از مواد که شک می آورد در نمونه باشد جداگانه به صورت نقاطی در همان ردیف قرار می دهند . ظرف دارای در را از حلال مناسب تا حد معینی پر کرده و کاغذ را در آن قرار می دهیم پس از بسته شدن در ظرف هوای داخل این محفظه تدریجا از حلال و آب اشباع شده و حلال شروع به پیشرفت در کاغذ نموده و در حین جلو رفتن مواد محتوی محلول مورد نظر را با خود به جلو می برد . ولی سرعت پیشروی برای این مواد یکسان نبوده و در نتیجه پس از مدتی اگر با خارج کردن کاغذ از داخل حلال عمل کروماتوگرافی را متوقف سازیم اجسام موجود در محلول به فاصله های مختلف از مبدأ حرکت قرار خواهد داشت . پس از قطع شدن آزمایش محل پیشروی حلال را روی کاغذ با مداد سیاه مشخص ساخته و کاغذ را در اتوو خشک می کنیم سپس با کمک معرف های ظاهر کننده مثل نین هیدرین لکه های مربوط را ظاهر ساخته و ضمن مقایسه با لکه های استاندارد محل لکه ها را از مبدأ قرار دادن لکه ها اندازه گیری می کنیم نسبت فاصله ای که جسم مورد آزمایش روی کاغذ تغییر محل داده ( d ) بر فاصله ای که حلال متحرک تغییر محل داده ( D) را با RF نشان می دهند .

علت استفاده از کروماتوگرافی کاغذی TLC :
1) ارزان بودن که معمولا روی کاغذ صافی انجام می شود .
2) برای ترکیبات پولار یا قطبی بسیار مناسب است این روش تکنیک بسیار موثری برای جداسازی مقدار بسیار کم ترکیبات محلول در آب مثل اسیدآمینه ، نوکلئیک اسید و قند ها به حساب می آید . تقریبا در بیشتر موارد برای ترکیبات بیولوژیکی مثل ادرار و مشتقات آن ها و همچنین به میزان وسیعی در بیو شیمی و پزشکی مورد استفاده قرار می گیرد .
یکی از نواقص آن کندی آن می باشد که در مقایسه با سایر تکنیک های مدرن تجزیه ای کمتر رضایت بخش است.
کروماتوگرافی کاغذی (paper chromatoghraphy) 
اطلاعات اولیه:

انواع جداسازی‌های مختلف و ساده بر رویکاغذبه عنوان پیشروان کروماتوگرافی کاغذیتوصیف شده‌اند. این سیستم معمولا به عنوان نمونه بارزی ازسیستمتقسیمیدر نظر گرفته می‌شود که در آن فاز ساکنآباست و به وسیلهجذب سطحیبر رویمولکول‌های سلولزقرار می‌گیرد و مولکول‌های سلولز نیز به نوبه خود به وسیلهساختار الیافی کاغذدر وضعیت‌های ثابت نگهداشته می‌شود. امروزه ، به هر حال ، مشخص شده است که جذب سطحی اجزای فاز متحرک و حلشونده‌ها واثرات تبادل یوننیز نقش‌هایی را ایفامی‌کنند و کاغذ به هیچ عنوان تنها به صورتتکیه گاهبی اثر نیست. 
طرح کلی روش:

قطره‌ای از محلول حاوی مخلوطی که باید جدا شود را روی یک صفحهیا نوار کاغذ صافی در محل علامت گذاری شده قرار می‌دهند. در این محل ، قطره به صورتیک لکه حلقوی پخش می‌شود. وقتی که لکه خشک شده کاغذ را در یک ظرف مناسب سربسته طوریقرار دهند که یک سر آن درحلالانتخاب شده بهعنوان فاز متحرک فرو رود. حلال از طریق الیاف کاغذ در نتیجهعمل موئینگینفوذ می‌کند و نکته مهم این استکه سطح کاغذ نباید کاملا به وسیله حلال پوشانده شود. زیرا در این صورت ، اصلاجدا سازیصورت نمی‌گیرد یا نواحی خیلی پخشمی‌شوند. 
وقتی که جبهه حلال مسافت مناسبی را طی کرد یا بعد از یک زمان ازقبل تعیین شده ، کاغذ را از طرف بیرون آورده ، جبهه حلال را با علامتی مشخص می‌کنندو می‌گذارند تا صفحه خشک شود. وقتی که محل‌های مناطق جدا شده آشکار شدند لازم استکه هر یک از اجسام به طور جداگانه شناسایی شوند. در موارد ایده‌آل ، هر جسم باواکنشگر مکان‌یاب ،رنگمخصوصی می‌دهد که در موردموادمعدنیبیشتر و درموردمواد آلیکمتر مشاهده می‌شود. ساده‌ترین روششناسایی بر اساس مقدار Rf یعنی نسبت فاصله طی شده به وسیله جبهه حلالاست. 
روش کمی کروماتوگرافی کاغذی:

کاربرد کمی این روش نه تنها احتیاج به یکجداسازی کمی، بلکه مکان‌یابی و ارزیابی کمیاجسام موجود نیز دارد. یک جداسازی کیفی رضایت بخش ، الزاما برای کار کمی مفید نیست. اندازهگیری کمیرا می‌توان یا با سنجش مقدار جسم موجود در لکه روی کاغذ ، یا با خارجکردن جسم از کاغذ و تجزیه اجزای جدا شده به وسیله روش‌های کمی متداول انجام داد. لکه اولیه از نمونه مناسب روی کاغذ قرار می‌دهند، خشک کردن لکه باید تحت شرایطاستانداردزمانودماصورت گیرد.
درتهیه حلال باید دقت زیادی روی نسبت‌های اجزای صورت گیرد، برقرار ساختن تعادل بایدبه طور استاندارد انجام گیرد، طول عبورحلالدر تمامی نوبت‌هایکسان باشد، در طول آزمایش ، دما باید ثابت بماند، و خشک کردن ورقه باید در یک زمانو دمای استاندارد انجام گیرد. واکنشگر مکان‌یاب (در صورت استفاده از لکه‌های رنگی) باید به طریق کاملا تکرارپذیر افزوده شود. و هر عمل بعدی ، مانند خشک کردن یاقراردادن در معرضبخارآمونیاک، باید در مدت استاندارد انجام گیرد. مقدار جسمی که در یکجداسازی کروماتوگرافیباید روی کاغذ قرارگیرد، متغیر است. 
روش کار:
1- ابتدا یک گرم از برگ اسفناج را با ترازو وزن کرده و آنها را ریز کنید و سپس درون هاون با مقدار 5 سی سی استون 80% بسایید تا محلولی یکنواخت بدست آید.
2- درون بشر مقدار 20 سی سی اتر نفت ریخته و درپوش آلومینیومی روی آن قرار دهید تا به حالت اشباع درآید.
3- با استفاده از خط کش کاغذهای کروماتوگرافی به عرض 5cm و طول 10cm تهیه کنید.
4- سپس مقداری از محلول را به کمک پی پت پاستور برداشته و نقاطی به قطر 0.5cm در فاصله 2cm از پایین کاغذ قرار دهید.
5- کاغذ کروماتوگراف را درون بشر تهیه شده قرار داده و با استفاده از فویل دهانه آنرا مسدود کنید و 20 تا 30 دقیقه منتظر بمانید تا محلول از کاغذ بالا رود.
6- کاغذ را بگذارید تا خشک گردد و تغییرات حاصله را بررسی کنید.
نکته: این آزمایش را می توانید به کمک گچ انجام دهید. بدین صورت که 1 سانتیمتر از انتهای گچ را با ناخن یا شی نوک تیز بتراشید و با استفاده از پی پت پاستور محلول را در شیار ایجاد شده بریزید و در بشر قرار دهید تا محلول از گچ بالا رود.
نکته: در این آزمایش اشباع بودن بشر از حلال(اترنفت) باعث بالا رفتن سرعت حلال از فاز ثابت می گردد. 
نتیجه: در این آزمایش رنگدانه های برگ اسفناج بر اساس سبک بودن رنگ ایجاد می کنند. 

[/vip-members]

 

1

نظر

  1. یاسمن  می 18, 2017

    عالی بود.ممنون