رنگ آمیزی و ازمون گرم

معروفترین نوع رنگ آمیزی مرکب نوع گرم می باشد . این روش مفیدترین روش تشخیص باکتریها می باشد.

میکروبشناسی بنام کریستیان گرم در سال ۱۸۸۴ بطور تصادفی واکنشی را کشف کرد که بعدها واکنش رنگ آمیزی گرم نامیده شد.

بر این اساس باکتریها با توجه با ساختمان دیواره یاخته ای (سلولی) به دو بخش بزرگ و کلی تقسیم می شوند: باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی . تفاوت عمده بین این دو گروه تفاوتهای ساختاری(ساختمانی) بین این دو گونه می باشد به این ترتیب که در گونه گرم مثبتها در دیواره سلولی نوعی پلی ساکارید بکار رفته و دیواره سلولی آن کمی ضخیمتر می باشد در صورتیکه در دیواره سلولی نوع گرم منفی مقدار چربی بیشتری بکار رفته و دیواره سلولی آن کمی نازکتر از نوع گرم منفی می باشد.

بر همین اساس در رنگ آمیزی گرم با توجه به این تفاوت مهم در دیواره سلولی ، از دو نوع رنگ استفاده می شود ، رنگ اولیه کریستال ویوله می باشد . هنگامیکه محلول کریستال ویوله به گسترش باکتریایی اضافه می شود این رنگ با ریبونوکلئات موجود در دیواره سلولی ترکیب شده و کمپلکس کریستال ویوله – ریبونوکلئات را بوجود می آورد و بعد از شستشوی رنگ اضافی ، محلول ید را بکار می برند . این محلول ید که ترکیبی فلزی می باشد به رنگ متصل شده و یک ترکیب رنگی غیر محلول ایجاد می کند بنام کمپلکس کریستال ویوله –ید که در سر دیگر آن متصل شده به ریبونوکلئات موجود در دیواره سلولی و تشکیل کریستال ویوله – ید – ریبونوکلئات داده است در حالیکه در باکتریهای گرم منفی چنین کمپلکسی ایجاد نمی شود. این پیوند در باکتریهای گرم مثبت بسیار

[vip-members]

پایدار است و در مرجله بعدی توسط ماده رنگ بر شکسته نمی شود و رنگ بنفش کریستال ویوله را در خود حفظ کرده بنابراین باکتریهای گرم مثبت زیر میکروسکوپ بنفش رنگ دیده می شوند.

از طرفی در دیواره سلولی باکتریهای گرم منفی مقدار چربی بیشتری بکار رفته است بنابراین چربیها در الکل استن که در مرحله بعدی بعنوان رنگ بر بکار می روند ، محلول هستند و در اثر این واکنش چربیها از دیواره سلولی خارج شده و در اثر شستشو با حلال رنگ بر ، رنگ کریستال ویوله هم از سطح باکتری خارج می شود . با خروج چربی توسط ماده رنگ بر ، بر اندازه منافذ دیواره سلولی افزوده شده که این امر باعث بی رنگ شدن سریع باکتریهای گرم منفی می شود .در این مرحله باکتریهای گرم منفی از کریستال ویوله پاک می شوند . بنابراین بعد از شستشو توسط آب و افزوده شدن رنگ دوم یعنی سافرانین (فوشین) ، این رنگ به دیواره سلولی باکتریهای گرم منفی جذب شده و باکتریها به رنگ قرمز در می آیند و در بررسی میکروسکوپی ، باکتریهای گرم منفی برنگ قرمز دیده می شوند.

اکثر باکتریهای موجود ، گرم منفی هستند البته بعضی از باکتریها ، مخمرها و تعدادی از کپکها گرم مثبت هستند.

بنابراین مراحل رنگ آمیزی گرم را می توان به شرح زیر بیان نمود:

۱- تهیه گسترش روی لام : ابتدا از نمونه باکتری یک گسترش روی لام تهیه می کنید.

۲- رنگ آمیزی با کریستال ویوله : در این مرحله مقداری از رنگ کریستال ویوله را با قطره چکان به روی سطح گسترش میکروبی روی لام بریزید و بگذارید ۱ دقیقه بماند تا رنگ در دیواره سلولی میکروبها نفوذ کند.

۳- مرحله شستشو: پس از سپری شدن مدت زمان ۱ دقیقه ، رنگ اضافی روی لام را خالی کرده و با استفاده از آب مقطر سطح روی گسترش را شستشو دهید.

۴- مرحله اضافه کردن محلول ید : جند قطره از محلول ید را روی گسترش پخش نموده و بگذارید بمدت ۱ دقیقه به همان حالت بماند . بعد محلول اضافی را خالی کرده و با آب مقطر لام را شستشو دهید.

۵- مرحله رنگ بری با استفاده از استن – الکل : لام را با زاویه ۴۵ درجه نگهدارید بعد با استفاده از محلول رنگ بر الکل – استن که بر روی گستره می ریزید بسرعت آنرا بی رنگ کنید. دقت کنید مرحله بی رنگ سازی بیش از اندازه نباشد. بعد از آن لام را بسرعت بشوئید . این عمل ، بی رنگ شده را متوقف خواهد کرد.

۶- رنگ آمیزی با سافرانین : در این مرحله سطح گسترش را با رنگ ثانویه یعنی سافرانین بپوشانید و ۳۰ تا ۶۰ ثانیه صبر کنید . بعد از آن رنگ اضافی را خالی کرده و با آب مقطر لام را شستشو دهید.

۷- لام رنگ آمیزی شده را آهسته روی کاغذ خشک کن قرار دهید ولی کاغذ را روی گسترش نکشید.

نکات مهم :

۱- حرارت بیش از اندازه هنگام تثبیت گسترش باعث پاره شدن دیواره سلولی باکتری شده . بنابراین باکتری گرم مثبت رنگ اولیه (کریستال ویوله) را هنگام رنگ بری از دست می دهد و رنگ ثانویه را جذب می نماید و در نتیجه باکتری گرم مثبت ، بصورت گرم منفی دیده می شود.

۲- اگر گسترش ضخیم باشد هنگام مرحله بی رنگ شدن ، ممکن است مانند یم گسترش معمولی رنگ نشود و این مسئله باعث خطا در تشخیص شما در گرم منفی یا مثبت بودن باکتری خواهد شد.

۳- غلظت درست و تازه بودن رنگها هم در رنگ آمیزی موثر است .

۴- رنگ بری بیش از حد ممکن است باعت پاره شدن جدار باکتریهای گرم مثبت شده در نتیجه این باکتریها رنگ کریستال ویوله خود را از دست داده و رنگ ثانویه را جذب می نماید و بصورت گرم منفی دیده می شود.

۵- دقت شود هنگام تهیه گسترش روی لام از محیط کشت ، سن کشت باکتری باید ۲۴ ساعت یا کمتر باشد . بنابراین در محیط کشتهایی که از عمر آنها گذشته و کهنه شده اند ، در قابلیت نفوذ دیواره سلولی باکتریها تغییراتی حاصل می شود که خاصیت گرم مثبت بودن را از دست می دهد.

در رنگ آمیزی گرم مثبت باکتریها را به ۵ گروه تقسیم بندی می کنند:

۱- میله ای (باسیل ) گرم مثبت ۲- میله ای گرم منفی ۳- کوکوس (گرد) گرم مثبت ۴- کوکوس گرم منفی ۵- باکتریهای بدون واکنش به رنگ آمیزی گرم.

در این رنگ آمیزی می توان هر باکتری ناشناخته ای را در یکی از این ۵ گروه قرار داده و با اطمینان ۴ گروه دیگر را حذف کرد و به مطالعه در مورد آن باکتری پرداخت .

خصوصیات باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی :

۱- باکتریهای گرم مثبت نسبت به پنی سیلین و مواد ضد باکتریایی حساستر از گرم منفی ها هستند.

۲- گرم مثبت بودن یک باکتری خصوصیتی است که براحتی از بین می رود اما گرم منفی بودن تحت هیچ شرایطی از بین نمی رود . پس هنگام تشخیص و رنگ آمیزی باید به این نکته هم توجه داشت . یعنی در لامهای رنگ آمیزی شده گرم متبت ، باکتریهای گرم منفی هم دیده می شود اما در لامهای گرم منفی از یک کشت خالص هرگز باکتریهای گرم مثبت دیده نمی شوند.

۳- باکتریهای گرم منفی سخت رشد ترند یعنی نیاز غذایی آنها پیچیده تر است .

۴- باکتریهای گرم منفی نسبت به مواد اسیدی و قلیایی قوی و آنزیم لیزوزیم حساسترند. همه اینها موجب پاره شدن دیواره سلولی این باکتری و هضم و متلاشی شده آن می شوند.

طرز تهیه رنگها و محلولهای گرم :

۱- کریستال ویوله :

– کریستال ویوله ۲ گرم

– اتانول ۹۵% ۲۰سی سی

– اگزالات آمونیوم(خالص) ۸/.گرم

– آب مقطر ۸۰سی سی

کریستال ویوله را در اتانول حل کنید. اگزالات آمونیوم را در آب حل کنیدو سپس دو محلول را روی هم ریخته و بخوبی مخلوط کنید.

۲- محلول ید:

– ید ۱ گرم

– یدور پتاسیم ۲ گرم

– آب مقطر ۳۰۰ سی سی

ید و یدور پتاسیم را با هم در هاون بسائید تا کاملا نرم شود . مقدار کمی آب اضافه کنید تا محتویات هاون شسته شود. بقیه آب را هم اضافه کرده و کاملا مخلوط کنید . این محلول را باید در شیشه تیره رنگ نگداری کنید.

۳- محلول سافرانین :

– سافرانین ۲۵ گرم

– اتانول ۹۵% ۱۰سی سی

– آب مقطر ۱۰۰سی سی

سافرانین را در اتانول حل کنید . آب مقطر را اضافه کرده و خوب مخلوط کنید . محلول را از کاغذ صافی عبور دهید.

۴- محلول استن – الکل :

– اتانول ۹۵% ۷۰ سی سی

– استن ۳۰سی سی

دو محلول را کاملا با هم مخلوط کنید.
کاربرد رنگ آمیزی گرم:
از رنگ‌آمیزی گرم به دو جهت استفاده می‌شود:
شناسایی جنس باکتری
انتخاب آنتی‌بیوتیک مناسب (باکتری‌های گرم مثبت در مقایسه با باکتری‌های گرم منفی نسبت به پنی‌سیلین G حسّاسیت بیشتری دارند(
با این حال همهٔ باکتری‌ها را نمی‌توان با رنگ‌آمیزی گرم مشاهده نمود

آزمون حلالیت در پتاس:

ابتدا یک قطره از محلول پتاس ۳% روی یک لام تمیز ریختیم.سپس توسط یک چوب کبریت مقداری از کشت تازه ی باکتری را برداشته و در محلول پتاس (KOH) به طور دورانی حرکت دادیم.و چوب کبریت را پس از ۱۵-۱۰ ثانیه از روی لام بالا کشیدیم.باکتری های گرم منفی در اثر تخریب دیواره و بیرون ریختن DNA و سایر مواد داخل سلول یک حالت چسبندگی و کشسانی نشان می دهند ، در صورتی که در مورد باکتری های گرم مثبت اینچنین نیست.باید در مورد زمان به هم زدن باکتری ها در KOH دقت کنیم زیرا باکتری های گرم مثبت هم اگر زیاد در پتاس بمانند دیواره ی سلولیشان تخریب شده و همان حالت کشسانی را از خود نشان می دهند.

رنگ آمیزی با کریستال ویوله:
۱- رنگ کریستال ویوله رابه مدت ۳۰تا۴۵ ثانیه برروی گسترش ریخته درنتیجه همه باکتری ها بهرنگ بنفش درخواهد درآمد
۲- پس از شستشو گسترش با آب به مدت ۳۰تا۴۵ ثانیه بالوگل می پوشانند لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده وایجاد کمپلکس های بزرگی می نمایید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری می شود . پس ازاین مرحله نیزکماکان همه باکتریها به رنگ بنفش مشاهده می شوند .
مرحله رنگ زدایی مهمترین مرحله رنگ آمیزی است دراین مرحله پس از شستشو لام با آب لام به مدت ۱۵ تا۲۰ ثانیه در معرض موادرنگ زدا مانند الکل استون قرار می گیرد سپس با آب مورد شستشو قرار می گیرد . درباکتریهای گرم منفی که دارای لایه های پپتیدو گلیکان محدود وغشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه ها وغشا می گردد وباکتری رنگ مراحل قبل راازدست می دهد . ولی درباکتریهای گرم مثبت به علت تعداد زیاد لایه های پپتیدوگلیکان وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل ازغشا خارج نمی شود .درنتیجه پس ازاین مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند .
۴- در انتها سطح گسترش راباسافرانین یا فوشین (قرمز رنگ) به مدت ۳۰ تا۴۵ ثانیه می پوشانیم سپس باآب شستشو داده و پس از خشک شدن بامیکروسکوپ مورد بررسی قرار میگیرد . دراین مرحله باکتریهای بی رنگ به رنگ قرمز درمی آیند وباکتری های بنفش بدون تغییر رنگ باقی می مانند .
[/vip-members]

 

3
  مطالب مرتبط

نظر

  1. محمدرضا  اسفند 7, 1391

    یه سوال … رنگایی که می ریزه رو روپوش رو چه جوری پاک کنیم؟

     پاسخ"  
    • بنیامین  اردیبهشت 16, 1396

      با استفاده از اب

       پاسخ"  
  2. nafas  دی 10, 1392

    سلام لطفا یه گزارش کار کامل از انواع روش های رنگامیزی تایپ شده برام بزارین

     پاسخ"  

ارسال پاسخ به nafas
 برای لغو پاسخ اینجا را کلیک کنید